Определение CRISPR
Сгруппированные регулярно пересекающиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) являются короткими, повторяющимися участками ДНК, обнаруженными у большинства архей и многих бактерии, CRISPR и CRISPR-ассоциированные белки (Cas) образуют адаптивную иммунную систему, которая защищает от чужеродных генетических элементов, таких как вирусы, плазмиды и транспозоны. Система CRISPR / Cas9 также обеспечивает основу для инструмента редактирования генома, который можно использовать для постоянной модификации генов особым целевым образом.
Особенности CRISPR Loci
Локусы CRISPR состоят из AT-богатой лидерной последовательности, за которой следуют краткие, короткие нуклеотид повторы разделены спейсерными областями. Многие из повторов являются палиндромными, с предсказанной вторичной структурой РНК-шпильки, в то время как другие не обладают симметрией и, по прогнозам, образуют неструктурированную РНК. Повторения сохраняются в локусе CRISPR, в то время как спейсеры очень вариабельны и соответствуют ДНК, полученной в результате воздействия чужеродной ДНК, такой как вирусы и плазмиды. Длина повторов CRISPR и проставок варьируется; повторы имеют длину 23-55 пар оснований, а проставки имеют длину 21-72 пар оснований. Массивы CRISPR обычно расположены рядом с кластерами генов Cas. Гены Cas кодируют широкий спектр белков, которые имеют функциональные домены, обнаруженные в геликазах, нуклеазах, полимеразах и других нуклеотидсвязывающих белках. Белки Cas выполняют функции по приобретению спейсерной ДНК, процессированию РНК и связыванию и расщеплению мишеней. Локусы CRISPR были обнаружены примерно у 90% архей и 40% бактерий, и организм Геном может содержать один или несколько локусов CRISPR (до 18 наблюдалось в одном организме).
CRISPR Классы и Типы
Существует два класса систем CRISPR / Cas, которые называются класс 1 и класс 2. Системы класса 1 используют несколько белков Cas для расщепления чужеродной ДНК, в то время как системы класса 2 используют один белок Cas. Классы делятся на типы; Класс 1 содержит типы I, III и IV, а класс 2 содержит типы II, V и VI. Типы определяются ген обычно встречается только в пределах этого типа, а также присутствуют дополнительные гены Cas. Типы далее делятся на 19 подтипов.
Функция и механизм CRISPR у прокариот
CRISPR обеспечивает прокариотам приобретенный иммунитет против инвазивных генетических элементов. Эти локусы включают генетический материал из вирусов и плазмид и используют его для нацеливания на чужие генетические элементы последовательным образом. Этапы защиты от чужеродных генетических элементов с использованием системы CRISPR / Cas заключаются в получении спейсерной ДНК от вторжения вирус биогенез CRISPR РНК (кРНК), которая позволит распознавать чужеродную ДНК, и вмешательство, при котором инвазивная ДНК распознается и расщепляется.
Приобретение Spacer DNA
Когда прокариотическая клетка заражен вирусом, образцы вирусной ДНК отбираются и включаются в спейсерные области локуса CRISPR. Нуклеазные ферменты Cas1 и Cas2 участвуют в приобретении спейсера в E.coli и, вероятно, во всех системах CRISPR / Cas, поскольку они являются единственными белками Cas, которые, как было обнаружено, сохраняются во всех системах. ДНК, которая отбирается и включается в локусы CRISPR в качестве спейсеров, может располагаться рядом с соседними мотивами протоспейсера (PAM) внутри вирусного генома; PAM играют важную роль в отборе чужеродных нуклеиновых кислот в системах типа I и типа II. Спейсеры обычно добавляются рядом с лидерной последовательностью, хотя новый спейсер также может быть вставлен случайным образом в массив повторяющихся спейсеров.
биогенез кРНК
После включения чужеродной ДНК в локус CRISPR последовательность CRISPR транскрибируется и перерабатывается в небольшие интерферирующие кРНК. Массив повтора-спейсера первоначально транскрибируется в единый транскрипт, который затем обрабатывается белками Cas в crRNAs, которые впоследствии служат руководством для нацеливания на чужеродные нуклеиновые кислоты. Биогенез кРНК отличается в разных системах CRISPR. В некоторых системах типа I белки Cas расщепляются по краю стеблевых петель в длинном транскрипте с образованием меньших кРНК. В системах типа II транскрибирующая кРНК (tracrRNA) транскрибируется, которая комплементарна повторам CRISPR, что приводит к образованию двухцепочечной РНК (дцРНК). ДцРНК расщепляется РНКазой III с образованием кРНК.
интерференция
Во время интерференционной стадии кРНК связываются с белками Cas, образуя комплекс, который распознает, направляет и уничтожает вирусный генетический материал. Пары базы кРНК с комплементарной последовательностью в вирусной ДНК, маркируя ее для разрушения. Распознавание последовательности PAM может также потребоваться для распознавания чужеродной ДНК. В системах типа II Cas9 выполняет стадию интерференции, используя как кРНК, так и тракрРНК, что позволяет ему распознавать чужеродную ДНК. В дополнение к распознаванию последовательностей-мишеней Cas9 обладает эндонуклеазной активностью и расщепляет чужеродную ДНК.
Система CRISPR / Cas была использована как метод молекулярной биологии для целевого редактирования генома. Редактирование генома осуществляется с использованием системы CRISPR / Cas9. Белок Cas9 представляет собой ДНК-эндонуклеазу, которая использует направляющую РНК для нацеливания и расщепления ДНК. Нативный Cas9 использует направляющую РНК, состоящую из кРНК и транс-активирующей РНК CRISPR (tracrRNA); для целей редактирования генома эта система была упрощена путем слияния кРНК и тракрРНК с образованием единой направляющей РНК. Система CRISPR / Cas9 может также включать шаблон восстановления, который используется для восстановления ДНК с помощьюгомологичны конец присоединения или гомология направленного ремонта. Изменяя последовательность направляющей РНК, систему CRISPR / Cas9 можно использовать для нацеливания на любую последовательность ДНК, а также для нокдауна, активации или мутации желаемой последовательности. Компоненты системы CRISPR / Cas9 часто включаются в плазмида это используется для трансфекции клеток для редактирования генома. Несколько изменений могут быть сделаны одновременно; в одном случае 62 гена были изменены одновременно.
Активация и репрессия генов
CRISPR, который не обладает нуклеазной активностью (обозначается как dCas9), можно использовать для нацеливания на конкретную последовательность для активации или подавления. Устраняя способность разрезать ДНК, система CRISPR / Cas9 может использоваться для нацеливания на гены без их расщепления. Cas9, лишенный нуклеазной активности, блокирует одни транскрипция в бактериальных клетках; в клетках млекопитающих включены дополнительные белки. Транскрипционные факторы также могут быть связаны с Cas9, что позволяет активировать гены-мишени.
Изменение генетической последовательности
Матрица репарации ДНК может быть включена в систему CRISPR / Cas9, которая позволяет включать эту последовательность ДНК в желаемое место. Восстановительный шаблон выходит за пределы местоположения расщепленной секции ДНК. Как только разрыв ДНК введен, клетка Механизм репарации ДНК использует матрицу для репарации ДНК, тем самым постоянно изменяя последовательность ДНК.
Приложения CRISPR
Технология CRISPR может использоваться для точных генетических изменений в различных типах клеток и организмов, включая клетки мышей, растений, рыб и человека. CRISPR может быть использован для создания животных моделей заболевания путем сбивания или нацеливания на ген интереса. CRISPR также может быть использован для создания клеточных линий, которые содержат мутации, вызывающие заболевание, и может быть использован для изучения молекулярных механизмов заболевания. CRISPR также имеют многообещающие терапевтические применения; они могут быть эффективными для борьбы с вирусами, такими как герпесвирус, и предотвращения их репликации у людей, были использованы для лечения генетических нарушений у животных и были одобрены для клинических испытаний при лечении рака. Помимо биомедицинских применений, CRISPR может также использоваться для создания штаммов дрожжей, производящих биотопливо, а также пищевых культур.
викторина
1. Система CRISPR / Cas обеспечивает адаптивный иммунитет против чужеродных генетических элементов у каких типов организмов?A. бактерииB. ArchaeaC. эукариотыD. А и Б
Ответ на вопрос № 1
D верно. Локусы CRISPR обнаружены в ~ 40% бактерий и ~ 90% архей, где они обеспечивают организм приобретенным иммунитетом против вирусов и плазмид.
2. Что делает Cas9 после связывания ДНК, которая комплементарна его направляющей РНК?A. Копирует этоB. Режет этоC. Транскрибирует этоD. Все вышеперечисленное
Ответ на вопрос № 2
В верно. Cas9 является эндонуклеазой ДНК, которая расщепляет ДНК, которую он обнаруживает, чтобы быть комплементарной его направляющей РНК.
3. Что из перечисленного не является функцией CRISPR?A. Содержат палиндромные повторы ДНКB. Высоко консервативные спейсерные областиC. Обеспечить адаптивный иммунитет к бактериям и археямD. Используется как инструмент молекулярной биологии для редактирования генома
Ответ на вопрос № 3
В верно. Локусы CRISPR содержат спейсерные области, которые не являются консервативными. И наоборот, они сильно изменчивы и соответствуют инвазивным генетическим элементам, полученным из вирусов и плазмид.
Ссылки
- Чен, К.Ю. и Knoepfler, P.S. (2016). «Для CRISPR и далее: эволюция редактирования генома в стволовых клетках». Регенеративная медицина. 11 (8): 801-816.
- Доечман Т. и Георгиева Т. (2017). «Редактирование генов с помощью РНК-направленной нуклеазы CRISPR / Cas9». Исследование кровообращения. 120 (5): 876-894.
- Паттерсон А.Г., Евстигнеева М.С. и Финеран П.С. (2017). «Регуляция CRISPR-Cas адаптивных иммунных систем». Текущее мнение в микробиология, 37: 1-7.
- Salsman, J. and Dellaire, G. (2017). «Точное редактирование генома в эпоху CRISPR». биохимия и клеточная биология. 95 (2): 187-201.