Проточная цитометрия – определение, протокол и тест

Определение

Проточная цитометрия – это процесс, используемый для анализа клетка характеристики. Использование лазера и флуоресцентно меченных белков, таких параметров, как размер клетки, здоровье и фенотип можно определить. Проточная цитометрия настолько рафинирована, что можно отслеживать отдельные белки. Таким образом, мы можем проанализировать внутреннюю работу ячейки и сигнальные сети.

Проточная цитометрия объяснила

Проточная цитометрия может использовать либо лазерное излучение, либо электрический импеданс (электронная мера сопротивления тока в цепи переменного тока), она работает по тому же принципу. Клетки подвешены в потоке жидкости и по одному проходят сквозь фокус возбуждающего света.

Поскольку белки или представляющие интерес компоненты клетки были флуоресцентно помечены антитела, излучающий свет будет рассеиваться на отдельные длины волн, которые считываются электронным устройством обнаружения. Затем он переводит рассеянный свет в поддающиеся количественной оценке физические и химические свойства частиц в жидкости. Эта способность занимает место проточной цитометрии в качестве важнейшего биомедицинского инструмента для анализа клеток и их компонентов.

Протокол проточной цитометрии

В то время как лаборатории по всему миру продолжают оптимизировать протокол проточной цитометрии, условно включает следующие этапы:

Клетки фиксируются с формальдегид иммобилизовать представляющие интерес белки и их преходящие сигнальные события.

метанол или детергент добавляется в пробирку, чтобы сделать клетки проницаемыми для антител, которые затем могут попасть в их внутриклеточные пространства.

Флуоресцентно меченные антитела добавляются и должны выбираться тщательно, чтобы обеспечить оптимальное нацеливание эпитопов и правильное обнаружение антигена при одновременном окрашивании нескольких поверхностных и внутриклеточных белков.

Пробирку помещают в проточный цитометр, и жидкости позволяют достичь – и затем выйти через – проточную камеру, по одной ячейке за раз.

Когда каждая ячейка пересекает лазерный луч, свет, который отражается от нее, передается на детекторы света / цвета.

Данные, полученные из этого эксперимента, могут, наконец, подвергнуться анализу, чтобы выявить уникальные аспекты самих клеток и их паттерны клеточная сигнализация,

антитело окрашивание также может варьироваться:

• При прямом окрашивании клетки инкубируют с антителом, непосредственно конъюгированным с флуорохромом (например, FITC). Это одностадийная инкубация, которая особенно полезна для внутриклеточного окрашивания.
• При непрямом окрашивании первичное антитело не метится, а вместо этого детектируется вторичным антителом, меченным флуорохромом. Этот метод означает, что неконъюгированные первичные антитела могут быть получены против множества различных мишеней, что расширяет выбор целевых белков для исследователя.
• Внутриклеточное окрашивание относится к окрашиванию внутриклеточных антигенов.
• Наконец, белки, секретируемые клеткой, могут быть помечены и отслежены с помощью блока Гольджи с последующим внутриклеточным окрашиванием.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия имеет множество применений. В своем простейшем применении он может подсчитывать клетки, когда каждая пересекает лазерный луч. Проточная цитометрия также может сортировать клетки из гетерогенных смесей, соотнося световые сигналы, которые они излучают, с известной морфологией клеток и ген образцы выражения.

Многое можно сказать о самих излучающих частицах. Проточная цитометрия может выявить размер частиц, зернистость и интенсивность флуоресценции. Это также полезно при обнаружении биомаркеров, которые важны для понимания болезни. Фактически, мы можем использовать более одного специфического маркера типа клеток в сочетании с фосфорилированными эпитопами, чтобы обеспечить уникальный способ понимания сигнальных биомаркеров в клеточных смесях.

Более основные приложения проточной цитометрии включают исследования в:

Декодирование шаблонов сигнализации также имеет большое терапевтическое значение. Нормальные паттерны могут показать, как работают наркотики, и выявление нарушений нормальной передачи сигналов может дать нам представление о том, как развивается заболевание. Это обеспечивает проточную цитометрию, возможно, наиболее важную роль в диагностическом тестировании.

Анализ проточной цитометрии

Проточная цитометрия стала чем-то вроде золотого стандарта в патология, Он был использован в таких разных областях, как морская наука и растение биологии, но приобрел большую популярность для его клинического применения в онкология, нарушения иммунодефицита и пренатальная диагностика.

Его применения в диагностике первичных иммунодефицитных (PI) заболеваний столь же эффективны. Болезни ПИ представляют собой группу редких хронических заболеваний, которые подрывают иммунную систему больного от борьбы с инфекциями. Эти инфекции повторяются и могут повлиять на кожа, легкие, горло, головной мозг или даже желудочно-кишечного тракта и мочевыводящих путей. В то время как диагностика нарушений ПИ требует нескольких тестов, проточная цитометрия является ключевой частью начальной обработки и последующего ведения.

В целом, разнообразные применения проточной цитометрии делают ее использование очень перспективным, и, по прогнозам, она будет занимать заметное место в рутинных посещениях больниц и клиник на долгие годы.

викторина