Определение гель-электрофореза
Гель-электрофорез – это процедура, используемая для разделения биологических молекул по размеру. Разделение этих молекул достигается путем помещения их в гель с небольшими порами и создания электрического поля через гель. Молекулы будут двигаться быстрее или медленнее в зависимости от их размера и электрического заряда.
Обзор гель-электрофореза
Процесс гель-электрофореза работает, потому что отрицательно заряженные молекулы удаляются от отрицательного полюса электрического тока, и более мелкие молекулы будут двигаться быстрее, чем более крупные молекулы. Таким образом, разделение по размеру достигается в пуле молекул, проходящих через гель. Гель работает аналогично сите, разделяющему частицы по размеру. Электрофорез работает для перемещения частиц, используя свойственный им электрический заряд, через сито.
Когда исследователи пытаются различить различные сегменты ДНК Например, процесс прост. Образцы загружают в каналы в начале геля. Каждая ДНК молекула имеет одинаковый заряд (-1), потому что ДНК образуется тем же 4 нуклеотиды и всегда несет слегка отрицательный заряд, независимо от его размера. Следовательно, каждая молекула ДНК будет иметь одинаковую силу, протягивая ее через гель.
Однако размер каждой молекулы препятствует ее прохождению через гель. Большие молекулы ударяются о части матрицы геля и замедляются. Маленькие молекулы ДНК могут проскользнуть между различными компонентами гелевого матрикса и быстро пробраться на другую сторону геля. Через определенное время можно увидеть, что окрашенные молекулы ДНК агрегируют в разных областях геля в зависимости от того, насколько далеко они продвинулись во время гель-электрофореза. Это позволяет исследователям идентифицировать сегменты и сравнивать ДНК разных организмов.
Для чего нужны гелевые электрофорезы?
Целью гель-электрофореза является визуализировать, идентифицировать и различать молекулы которые были обработаны предыдущим методом, таким как ПЦР, ферментативное пищеварение или экспериментальное состояние. Часто смеси нуклеиновых кислот или белков, которые собираются из предыдущего эксперимента / метода, проходят гель-электрофорез для определения идентичности или дифференциации между молекулами.
Гель электрофорез шаги
Широкие шаги, включенные в общий протокол гель-электрофореза ДНК:
1. Подготовка образцов для работы
ДНК выделена и предварительно обработана (например, ПЦР, ферментативное расщепление) и составил в решение с некоторым основным синим красителем, чтобы помочь визуализировать движение образца через гель.
2. Готовится раствор геля агарозы ТАЕ
TAE-буфер обеспечивает источник ионов для настройки электрического поля во время электрофореза. От массы к объему концентрация агарозы в буфере TAE используется для приготовления раствора. Например, если требуется 1% агарозный гель, 1 г агарозы добавляют к 100 мл TAE. Используемый процент агарозы определяется тем, насколько большой или маленькой должна быть ДНК. Если посмотреть на разделение пула меньших по размеру полос ДНК (<500bp), a higher percentage agarose gel (>1%) готово. Более высокий процент агарозы создает более плотное сито для увеличения разделения небольших различий в длине ДНК. Раствор агарозы-ТАЕ нагревают для растворения агарозы.
3. Литье геля
Агарозный раствор ТАЕ представляет собой наливают в кастрюлю что после охлаждения и затвердевания раствора геля образуется гелевая плита с рядом лунок наверху.
4. Настройка камеры электрофореза
Твердый гель помещают в камеру, заполненную ТАЕ буфер. Гель расположен так, что лунки камеры расположены ближе всего к отрицательному электроду камеры.
5. Загрузка геля
гелевые камеры загружаются с образцами ДНК и, как правило, Лестница ДНК также загружается в качестве ссылки для размеров.
6. Электрофорез
Отрицательные и положительные выводы подключены к камере и к источнику питания, где установлено напряжение. При включении питания настраивается электрическое поле и отрицательно заряженные образцы ДНК начнут мигрировать через гель и уходить от отрицательного электрода к положительному.
7. Остановка электрофореза и визуализация ДНК
Как только синий краситель в образцах ДНК прошел через гель достаточно далеко, источник питания отключается, и гель удаляется и помещается в раствор бромида этидия. Этидий бромид интеркалирует между ДНК и виден в ультрафиолетовом свете. Иногда бромид этидия добавляют непосредственно к раствору в агарозном геле на этапе 2. Затем гель, окрашенный бромидом этидия, подвергают воздействию ультрафиолетового света и делают снимок. Полосы ДНК визуализируются в каждой дорожке, соответствующей ячейке камеры. Лестница ДНК, которая была загружена, также визуализируется, и можно оценить длину полос ДНК. Пример приведен на рисунке ниже.
Денатурация РНК или белка достигается путем добавления восстановителя к образцу, геля и / или буфера. Восстановитель разделяет связи внутри молекулы РНК или белка и тем самым снижает ее вторичную структуру. Вторичная структура белка или РНК будет нелинейным образом влиять на скорость его миграции через гель. Однако денатурированная линейная форма РНК или белка будет мигрировать пропорционально своему линейному размеру (парам оснований или килодальтонам). Денатурирующий гель-электрофорез часто более точен для определения размера, тогда как нативный гель-электрофорез обычно используется для идентификации более крупных белковых комплексов.
Примеры гель-электрофореза
- TAE Агарозный гель Электрофорез наиболее часто используется для ДНК.
- TBE и денатурирующий PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле) являются общими для разделения РНК.
- SDS PAGE представляет собой денатурирующий гель-электрофорез, обычно используемый для идентификации и разделения белка.