Определение секвенирования ДНК
Секвенирование ДНК – это процесс определения последовательности нуклеотидов в ДНК молекула, каждый организм ДНК состоит из уникальной последовательности нуклеотидов. Определение последовательности может помочь ученым сравнить ДНК между организмами, что может помочь показать, как эти организмы связаны.
Обзор секвенирования ДНК
Это означает, что, упорядочив отрезок ДНК, можно будет узнать порядок, в котором четыре нуклеотид основы – аденин, гуанин, цитозин и тимин – происходят в этом нуклеиновая кислота молекулы.
Необходимость секвенирования ДНК впервые стала очевидной из теории Фрэнсиса Крика о том, что последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК непосредственно влияет на аминокислотные последовательности белков. В то время считалось, что полностью секвенированный геном приведет к квантовому скачку в понимании биохимия клеток и организмов.
Современное секвенирование ДНК состоит из высокопроизводительных методов, которые позволяют обнаружить целые последовательности ДНК за считанные часы. Эта технология позволила многим компаниям начать предлагать тестирование ДНК на дому. Многие из «результатов», найденных этими тестами, являются просто корреляциями, найденными между генетическим вариантом и определенным состоянием. Тем не менее, технология также позволила ученым проверить ДНК многих организмов, чтобы лучше понять эволюционные связи.
Пример секвенирования ДНК
Хотя секвенирование ДНК раньше занимало годы, теперь это можно сделать за часы. Далее, первая полная последовательность человеческой ДНК заняла около 3 миллиардов долларов. Теперь некоторые компании упорядочат весь ваш геном менее чем за 1000 долларов. Самые продвинутые тесты будут анализировать каждый нуклеотид в вашем геноме. Тем не менее, многие компании сейчас предлагают однонуклеотидный полиморфизм тесты.
Эти тесты фокусируются на отдельных нуклеотидах в генах, которые могут обозначать определенные генетические варианты. Эти SNP, как они известны, связаны с определенными условиями и могут помочь предсказать, как ваши гены могут влиять на вашу жизнь. Некоторые SNP связаны с различными заболеваниями, в то время как другие связаны с вашим метаболизмом и тем, как ваш организм перерабатывает питательные вещества. Были найдены тысячи различных корреляций, и можно использовать секвенирование ДНК, чтобы выяснить, как ваш геном влияет на вашу жизнь.
Методы секвенирования ДНК
Существует два основных типа секвенирования ДНК. Более старый, классический метод обрыва цепи также называется методом Сэнгера. Новые методы, которые могут быстро обрабатывать большое количество молекул ДНК, в совокупности называются методами высокопроизводительного секвенирования (HTS) или методами секвенирования следующего поколения (NGS).
Секвенирование
Метод Сэнгера опирается на праймер, который связывается с молекулой денатурированной ДНК и инициирует синтез одноцепочечного полинуклеотида в присутствии фермента ДНК-полимеразы, используя денатурированную ДНК в качестве матрицы. В большинстве случаев фермент катализирует добавление нуклеотида. Ковалентная связь поэтому образует между 3 ‘атомом углерода дезоксирибоза молекула сахара в одном нуклеотиде и 5 ‘атом углерода в следующем. Это изображение ниже показывает, как формируется эта связь.
Однако реакционная смесь для секвенирования имела бы небольшую долю модифицированных нуклеотидов, которые не могут образовывать это Ковалентная связь из-за отсутствия реактивного гидроксильная группа порождая термин «дидезоксирибонуклеотиды», то есть они не имеют 2 ’или 3 ′ атома кислорода по сравнению с соответствующим рибонуклеотидом. Это приведет к преждевременному прекращению реакции полимеризации ДНК. В конце нескольких циклов такой полимеризации будет создана смесь молекул различной длины.
В самых ранних попытках использования метода Сэнгера молекулу ДНК сначала амплифицировали, используя меченый праймер, а затем разделяли на четыре пробирки, каждая из которых имела только один тип ddNTP. То есть каждая реакционная смесь будет иметь только один тип модифицированного нуклеотида, который может вызвать обрыв цепи. После того, как четыре реакции были завершены, смесь молекул ДНК, созданная путем обрыва цепи, подвергалась электрофорезу в полиакриламидном геле и разделялась в соответствии с их длиной.
Со временем этот метод был модифицирован таким образом, чтобы каждый ddNTP имел различную флуоресцентную метку. Праймер больше не был источником радиоактивной метки или флуоресцентной метки. Этот метод, также известный как секвенирование терминатора красителя, использовал четыре красителя с неперекрывающимися спектрами излучения, по одному для каждого ddNTP.
Высокая пропускная способность
Секвенирование Сэнгера продолжает быть полезным для определения последовательностей относительно длинных участков ДНК, особенно в небольших объемах. Однако, это может стать дорогим и трудоемким, когда большое количество молекул должно быть быстро секвенировано. Как ни странно, хотя традиционный метод терминатора красителя полезен, когда молекула ДНК длиннее, высокопроизводительные методы стали более широко использоваться, особенно когда необходимо секвенировать целые геномы.
Есть три основных изменения по сравнению с методом Сэнгера. Первой была разработка клетка система для клонирования фрагментов ДНК. Традиционно участок ДНК, который нужно было секвенировать, сначала клонировали в прокариот плазмида и усиливается в бактерии перед извлечением и очисткой. Технологии секвенирования с высокой пропускной способностью или секвенирования следующего поколения больше не полагались на эту трудоемкую и длительную процедуру.
Во-вторых, эти методы создали пространство для параллельного запуска миллионов реакций секвенирования. Это был огромный шаг вперед по сравнению с первоначальными методами, где для получения одной надежной нуклеотидной последовательности требовалось восемь различных реакционных смесей. Наконец, нет разделения между этапами удлинения и обнаружения. Основания идентифицируются по мере протекания реакции секвенирования. Хотя HTS снизили стоимость и время, их «чтения» были относительно короткими. То есть для сборки всего генома необходимы интенсивные вычисления.
Появление HTS значительно расширило приложения для геномики. Секвенирование ДНК стало неотъемлемой частью фундаментальной науки, трансляционных исследований, медицинской диагностики и криминалистики.
Использование секвенирования ДНК
Традиционные технологии терминальной цепочки и методы HTS используются сегодня для различных применений. Секвенирование Сэнгера в настоящее время используется в основном для первоначального секвенирования молекулы ДНК для получения первичных данных о последовательности для организма или ген, Относительно короткое «чтение» происходит от реакции HTS (30-400 пар оснований по сравнению с почти тысячей базовая пара «Читает» из методов секвенирования Сангера) затрудняет создание всего генома организма только с помощью методов HTS. Иногда для подтверждения результатов HTS также требуется последовательность Sanger.
С другой стороны, HTS позволяет использовать секвенирование ДНК для понимания однонуклеотидных полиморфизмов – среди самых распространенных типов генетическая изменчивость в пределах Население, Это становится важным в эволюционной биологии, а также в обнаружении мутировавших генов, которые могут привести к болезни. Например, вариации последовательности в образцах аденокарциномы легкого позволили обнаружить редкие мутации, связанные с заболеванием. Сайты связывания хроматина для специфических ядерных белков также могут быть точно идентифицированы с использованием этих методов.
В целом, секвенирование ДНК становится неотъемлемой частью многих различных приложений.
диагностика
Секвенирование генома особенно полезно для выявления причин редких генетических нарушений. В то время как более 7800 заболеваний связаны с паттерном менделевского наследования, менее 4000 из этих болезней были окончательно связаны с конкретным геном или мутация, Ранний анализ экзон -геном или экзом, состоящий из всех экспрессируемых генов организма, показал многообещающую роль в выявлении причинных аллелей для многих наследственных заболеваний. В одном конкретном случае секвенирование генома ребенка, страдающего тяжелой формой воспалительного заболевания кишечника, связало заболевание с мутацией в гене, связанном с воспалением – XIAP. В то время как у пациента первоначально были множественные симптомы, указывающие на иммунодефицит, по результатам секвенирования ДНК была рекомендована пересадка костного мозга. Ребенок впоследствии излечился от недуга.
Кроме того, HTS был важным игроком в развитии лучшего понимания опухолей и раковых заболеваний. Понимание генетической основы опухоли или рака позволяет врачам иметь в своем комплекте дополнительный инструмент для принятия диагностических решений. Атлас генома рака и Международный консорциум по геному рака секвенировали большое количество опухолей и продемонстрировали, что эти разрастания могут значительно различаться с точки зрения их мутационного ландшафта. Это также позволило лучше понять, какие варианты лечения являются идеальными для каждого пациента. Например, секвенирование генома рака молочной железы идентифицировало два гена – BRCA1 и BRCA2 – чьи патогенные варианты оказывают огромное влияние на вероятность развития рака молочной железы. Люди с некоторыми патогенными аллелями даже предпочитают проводить профилактические операции, такие как двойная мастэктомия.
Молекулярная биология
Секвенирование ДНК в настоящее время является неотъемлемой частью большинства биологических лабораторий. Он используется для проверки результатов упражнений на клонирование, чтобы понять влияние определенных генов. HTS-технологии используются для изучения вариаций генетического состава плазмид, бактерий, дрожжей, нематод или даже млекопитающих, используемых в лабораторных экспериментах. Например, клеточная линия, полученная из рака молочной железы ткань называется HeLa, используется во многих лабораториях по всему миру и ранее считался надежной клеточной линией, представляющей ткани молочной железы человека. Недавние результаты секвенирования продемонстрировали большие различия в геноме клеток HeLa из разных источников, тем самым уменьшая их полезность в клеточной и молекулярной биологии.
Секвенирование ДНК дает представление о регуляторных элементах в геноме каждой клетки и об изменениях их активности у разных типов клеток и индивидуумов. Например, определенный ген может быть постоянно выключен в некоторых тканях, в то время как конститутивно экспрессируется в других. Точно так же люди с восприимчивостью к определенному заболеванию могут регулировать ген иначе, чем те, кто обладает иммунитетом. Эти различия в регуляторных областях ДНК могут быть продемонстрированы с помощью секвенирования и могут дать представление о основе для фенотип.
Последние достижения даже позволили отдельным лабораториям изучать структурные изменения в геноме человека – мероприятии, которое потребовало глобального сотрудничества два десятилетия назад.
Криминалистика
Возможность использовать низкие концентрации ДНК для получения надежных результатов секвенирования была чрезвычайно полезна для судебно-медицинских экспертов. В частности, потенциал для последовательности каждой ДНК в образце является привлекательным, особенно потому, что место преступления часто содержит генетический материал от нескольких людей. HTS медленно внедряется во многих криминалистических лабораториях для идентификации человека. Кроме того, последние достижения позволяют судмедэксперту упорядочить экзом человека после смерти, особенно для определения причины смерти. Например, смерть от отравления покажет изменения экзома в пораженных органах. С другой стороны, секвенирование ДНК может также определить, что умерший имел ранее существовавшую генетическую болезнь или предрасположенность. Проблемы в этой области включают разработку чрезвычайно надежного программного обеспечения для анализа, тем более что результаты HTS не могут быть проверены вручную.