Определение клеточной культуры
клетка культура – это метод, используемый для выращивания, размножения и выращивания большого количества клеток в чашке. Клетки могут быть смешанного, гетерогенного происхождения с ростом различных типов клеток, или они могут быть единичного типа клеток, иногда клонального происхождения. Клеточная культура позволяет выращивать клетки вне их естественной среды и контролировать условия, в которых они растут.
Клетки растут в чашке с определенной питательной средой и факторами, поддерживающими оптимальный рост. После того как клетки израсходовали большую часть среды и заняли пролиферацией все пространство в чаше для культивирования, они считаются «слитыми». Затем клетки «пассируют», что удаляет их из их сливной чашки, растворяет их в новые питательные среды и помещают их с низкой плотностью клеток в новую чашку для культивирования. Это позволяет клеткам продолжать размножаться и размножаться в оптимальных условиях культивирования. У большинства клеток есть ограниченное количество времени, в течение которого они могут расти в культуре из-за их генетически определенной продолжительности жизни клеток. Другие распространенные клетки культуры клеток были «трансформированы», что делает их бессмертными; они будут продолжать размножаться бесконечно при оптимальных условиях культивирования. Распространенным типом бессмертных клеточных линий являются раковые клеточные линии, такие как клетки HeLa.
Клеточные культуры также могут быть адгезивными или неприлипающими в своих условиях культивирования. Прилипшие типы клеток, такие как фибробласты или эпителиальные клетки, выращивают путем прикрепления к поверхности чашки для культивирования. Эти типы клеток должны быть физически отделены от их поверхности, чтобы проходить их. Неприлипающие типы клеток, такие как лимфоидные клетки, выращивают в суспензии в колбе для культивирования клеток – они обычно не прикрепляются к поверхности в их естественной среде или в условиях культивирования.
Приложения для культуры клеток
Клеточная культура широко используется в фундаментальных и клинических исследованиях. Он служит инструментом для исследований в области клеточной и молекулярной биологии, где исследователи могут тестировать лекарства и условия роста, а также выполнять генетические манипуляции с популяциями культивируемых клеток. Клеточную культуру мож��о использовать для создания уменьшенного источника ограничивающих факторов. Население клеток, найденных in-vivo, таких как стволовые клетки. Он также может быть использован для создания крупномасштабного производства некоторых клеточных продуктов, таких как антитело или секретируемый белок.
Клеточную культуру часто считают моделью in vitro (т.е. вне живой организм ) для нативного, биологического исследования клеток. Например, кожа эпителиальные клетки организма могут быть выделены и подготовлены для клеточной культуры; затем эти клетки могут быть трансдуцированы или трансформированы в избыточную экспрессию или уменьшить эпителиальный ген представляет интерес. Это может позволить исследователю проверить влияние интересующего гена на морфологию эпителиальных клеток, скорость роста, поведение и т. Д., Хотя тот же тип манипуляции с генами может быть невозможен in vivo (то есть внутри живого организма) или в таком контролируемом, специфичном для клеток типе метода, как культивирование клеток.
Протокол клеточной культуры
Материалы, необходимые для клеточной культуры:
- Источник клеток
- Среда для роста с необходимыми питательными веществами
- Факторы роста
- Культура блюд, подходящих для типа клеток
- Газовый и температурно-регулируемый инкубатор
Все этапы протокола должны быть предприняты в вытяжном шкафу для клеточных культур, который поддерживается для асептической техники, чтобы предотвратить загрязнение.
Шаг 1
Клетки могут быть выделены из первичного источника, такого как орган или ткань из живого организма или из вторичного источника, такого как замороженная клеточная линия.
Шаг 2
Рост СМИ решение получают с соответствующими факторами роста для типа клеток (например, эпидермальные факторы роста для эпидермальных клеток, цитокины для иммунных клеток). Среда должна быть стерильно отфильтрована и обычно содержит антибиотики для предотвращения бактериального загрязнения культуры клеток.
Шаг 3
Эти клетки подсчитываются, если количество еще не известно. Известное количество клеток осаждают и ресуспендируют в приготовленной питательной среде. Объем ресуспендирования клеток должен быть оптимальным для чашки для культивирования и для количества клеток на чашку (то есть плотность клеток).
Шаг 4
Ресуспензию клеток переносят в соответствующую культуральную чашку и осторожно встряхивают, чтобы создать равномерную дисперсию клеток на чашке.
Шаг 5
Чашку помещают в инкубатор с CO2 и O2, и температуру устанавливают соответствующим образом для клеточной линии или типа. Клеткам разрешено прикрепляться (если они прикреплены) и расти в течение следующих нескольких дней.
Шаг 6
Клеткам дают возможность расти оптимально и сливаться в течение следующих нескольких дней, регулярно используя свежую среду.
Шаг 7
Когда клетки достигли слияния, они готовы к пассированию. Это делается путем удаления среды роста и добавления среды диссоциации, чтобы клетки, если они прилипли к чашке, отделялись. После отделения клетки переносятся в пробирку, где они осаждаются и промываются несколько раз. Они также подсчитываются и обычно оцениваются по количеству погибших клеток. Новое количество клеток затем снова ресуспендируют и разбавляют в свежеприготовленной питательной среде, как и прежде, для соответствующей плотности клеток. Затем эту суспензию клеток высевают на новые чашки для культивирования и дают возможность снова расти до слияния.
Процесс можно продолжать до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество клеток или пассажей.
Загрязнение культуры клеток
Загрязнение клеточной культуры происходит, когда клетки заражаются бактерии, микоплазма, дрожжи и / или плесень. Использование асептической техники важно для предотвращения этого типа загрязнения. Это включает в себя максимально возможное использование стерильной рабочей среды, такой как специальный вытяжной шкаф, который дезинфицируется после каждого использования. Капюшон часто держат под ультрафиолетовым светом, когда он не используется, чтобы предотвратить рост микроорганизмов, и регулярно протирают 70% этанолом. Кроме того, реагенты, используемые во время культивирования клеток, такие как среда и факторы роста, должны храниться в стерильных условиях и обрабатываться стерильными инструментами и дозаторами.
Альтернативно, загрязнение клеточной культуры может также происходить небиологическими источниками, такими как химикаты, моющие средства или эндотоксины, которые появляются в среде или материалах, используемых для культивирования клеток.
викторина
1. Что из нижеперечисленного может применяться в культуре клеток?A. Крупномасштабное производство клетокB. In-vivo генетические исследованияC. Изучить физические характеристики органаD. Производство наркотиков
Ответ на вопрос № 1
верно. Применение культуры клеток может быть широким и разнообразным; однако из перечисленных возможностей наилучшим ответом является крупномасштабное производство клеток, поскольку клеточная культура может расширять небольшую исходную клеточную популяцию. Клеточная культура также считается моделью in vitro, а не моделью in vivo. Клеточная культура не воспроизводит целый орган, поэтому не может быть использована для изучения характера физического органа. Наконец, лекарства производятся химически, а не клетками.
2. Что из перечисленного является биологическим загрязнителем клеточной культуры?A. эндотоксиновB. MycoplasmaC. АнтибиотикиD. моющее средство
Ответ на вопрос № 2
В верно. Микоплазма – это разновидность бактерий, которые являются биологическим источником загрязнения клеточных культур. Все остальные ответы являются примерами небиологических веществ.
3. Как вы узнаете, когда клеточная культура достигла слияния?A. Клетки имеют очень низкую плотностьB. Есть загрязнение в культуреC. Клетки заняли почти все пространство для блюдD. Клетки пролиферируют
Ответ на вопрос № 3
С верно. Слияние достигается, когда клетки размножаются путем пролиферации и использования питательной среды для покрытия чашки для культивирования клеток. Как правило, клетки замедляют или останавливают пролиферацию, когда достигают слияния, потому что больше нет места для роста. Если клетки имеют низкую плотность, это означает, что они редки и имеют много места для расширения и роста.
Ссылки
- Gibco (2016). «Основы клеточной культуры» Thermo Fisher получены 2017-04-30 с сайта https://www.thermofisher.com/cellculturebasics